Autores: Andrés Romero - Osorio; Angie Romero - Coronel ; María Lares - Hernández; Emily Catalano - Donaire; María Martínez - Aguilera & Elizabeth Ferrer - Jesús

ABSTRACT

Toxocariasis is produced mainly by the canine parasite Toxocara canis (Warner, 1782). The human is infected by eggs from feces eliminated by dogs. Therefore, it is important to detect the existence of the parasite in soil samples. The aim of this work was to standardize the PCR technique for the detection of T. canis DNA in soil samples. Three DNA extraction protocols were used (salt precipitation, Chelex® 100 resin, and Promega Kit) to identify the quantity and quality of DNA were obtained from eggs, larvae and adults of the parasite. The optimum reaction conditions of the components of the PCR (dNTP, MgCl , 2 primers and Taq polymerase) and hybridization temperature and number of cycles of the PCR were determined. The analytical sensitivity and specificity of the technique were also determined and the standardized technique was used in soil samples contaminated with parasite DNA. The best DNA extraction protocol was the Promega kit, the optimal PCR conditions were: 200 µM dNTP, 1.5 mM MgCl , 2 0.4 µM primers, and 1 U of Taq polymerase and 35 cycles, at 55 °C. The sensitivity was 1 pg of DNAand the specificity was 100%. Inhibition was observed, which was reversed by adding bovine serum albumin to the reaction, achieving amplification of up to 1 pg of DNA, so that standardized PCR could be a tool useful for epidemiological studies and control programs

RESUMEN

La toxocariasis es producida principalmente por el parásito del perro Toxocara canis (Warner, 1782). El humano se infecta al ingerir los huevos eliminados en las heces del perro, por lo que es importante conocer la existencia del parásito en muestras de suelo. El objetivo de este trabajo fue estandarizar una PCR para la detección de ADN de T. canis en muestras de tierra. Se utilizaron tres protocolos de extracción de ADN (Precipitación salina, Resina Chelex® 100 y Estuche Promega), para identificar con cual se obtenía mejor cantidad y calidad de ADN a partir de huevos, larvas y adultos del parásito. Se determinaron las condiciones óptimas de reacción de los componentes de la PCR (dNTP, MgCl2 , cebadores, y Taq polimerasa), así como la temperatura de hibridación y número de ciclos. Se determinó la sensibilidad y especificidad analíticas y se empleó la técnica estandarizada en muestras de tierra contaminadas con ADN del parásito. El mejor protocolo de extracción fue el Estuche de Promega, las condiciones óptimas de la PCR fueron; dNTP 200 µM, MgCl 1,5 mM, cebadores 0,4 µM, y Taq polimerasa 1 U, 35 ciclos y 55 °C 2 como temperatura de hibridación. Se obtuvo una sensibilidad de 1 pg y 100% de especificidad. Al aplicar la PCR estandarizada en las muestras de tierra contaminadas con ADN del parásito se observó inhibición, la cual fue revertida al añadir albúmina sérica bovina a la reacción, logrando amplificar hasta 1 pg de ADN, por lo que la PCR estandarizada podría ser una herramienta útil para los estudios epidemiológicos y los programas de control.

Keywords: diagnosis – epidemiology – molecular techniques – toxocariasis – PCR – soil

Palabras clave: diagnóstico – epidemiología – técnicas moleculares – toxocariasis – PCR – tierra.

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